62/2000 حفاظت از سلامت نوزادان و کودکان کوچک

مقدمه

الیگوساکاریدهای شیر انسان (HMOs) گروهی از الیگوساکاریدها با درجه پلیمریزاسیون حداکثر ۳ هستند که به طور طبیعی در شیر انسان وجود دارند؛ آنها سومین جزء جامد بزرگ در شیر انسان، پس از لاکتوز و چربی هستند. آنها فلور روده را تنظیم می‌کنند - به ویژه با ترویج کلونیزاسیون بیفیدوباکتری‌ها در روده نوزاد - در حالی که سلامت روده را نیز حفظ می‌کنند، از رشد ایمنی و مغز حمایت می‌کنند و اثرات ضد عفونی کننده دارند و نقش مهمی در رشد نوزاد ایفا می‌کنند. از زمان عرضه اولین شیر خشک نوزاد غنی شده با HMO در ایالات متحده در سال ۲۰۱۵، طیف گسترده‌ای از شیر خشک نوزاد، محصولات لبنی و شیر، مکمل‌های سلامت گوارش و غذاهای کاربردی حاوی HMO در سراسر جهان به فروش رسیده‌اند. تا تاریخ ۱ ژوئن ۲۰۲۳، ایالات متحده و اتحادیه اروپا هفت HMO را برای استفاده تأیید کرده‌اند: ۲'-فوکوزیل لاکتوز، ۳'-فوکوزیل لاکتوز، دی فوکوزیل لاکتوز، لاکتو-ان-نئوتتروز، لاکتو-ان-تتروز، ۳'-سیالیل لاکتوز و ۶'-سیالیل لاکتوز.

در میان روش‌های متداول تشخیص HMO، کروماتوگرافی مایع نیاز به واکنش مشتق‌سازی قبل از تشخیص دارد، شامل آماده‌سازی پیچیده نمونه است و معرف‌های مشتق‌سازی اغلب سمی هستند؛ ماهیت حساس به حرارت HMOها نیز منجر به پاسخ پایین و تکرارپذیری ضعیف در LC-MS می‌شود. در مقابل، کروماتوگرافی یونی با آشکارسازی آمپرمتری برای کربوهیدرات‌ها، آماده‌سازی ساده نمونه، پاسخ بالا و تکرارپذیری خوب را ارائه می‌دهد و مزایای روشنی برای تجزیه و تحلیل HMO دارد. این یادداشت کاربردی از سدیم هیدروکسید، سدیم استات و آب فوق خالص که به صورت دستی آماده شده‌اند به عنوان الون استفاده می‌کند و از کروماتوگراف یونی WAYEAL IC6300 برای تعیین HMOها در شیر خشک نوزاد استفاده می‌کند. این روش دارای آماده‌سازی ساده نمونه، حساسیت بالا و خطی بودن خوب است و مرجع مفیدی برای تشخیص HMO در غذاها فراهم می‌کند.

کلیدواژه‌ها: کروماتوگراف یونی؛ الیگوساکاریدهای شیر انسان؛ آشکارساز آمپرمتری.

۱. ابزار، تجهیزات و معرف‌ها

۱.۱ معرف‌ها و استانداردها

جدول ۱. لیست معرف‌ها و استانداردها

۱.۲ مواد آزمایشگاهی و تجهیزات کمکی

• ۱.۲.۱ ترازوی تحلیلی (قابلیت خواندن ۰.۱ میلی‌گرم)؛
• ۱.۲.۲ حمام آب ترموستاتیک؛
• ۱.۲.۳ سانتریفیوژ؛
• ۱.۲.۴ فیلترهای غشایی پلی‌اترسولفون (PES) آبی (۰.۴۵ میکرومتر)؛
• ۱.۲.۵ آب فوق خالص؛
• ۱.۲.۶ دستگاه فیلتراسیون خلاء؛
• ۱.۲.۷ ستون‌های پیش‌تصفیه استخراج فاز جامد (SPE) RP؛
• ۱.۲.۸ سرنگ‌های یکبار مصرف (۲۰ میلی‌لیتر، ۵ میلی‌لیتر).

۲. روش تجربی

۲.۱ آماده‌سازی محلول

• ۲.۱.۱ محلول سدیم هیدروکسید ۲۰۰ میلی‌مولار: ۱۰.۵ میلی‌لیتر NaOH ۵۰٪ را پیپت کنید، با آب تا ۱۰۰۰ میلی‌لیتر رقیق کنید و تحت خلاء فیلتر کنید.
• ۲.۱.۲ محلول مخلوط NaOH ۷۵ میلی‌مولار و سدیم استات ۲۵۰ میلی‌مولار: ۲۰.۵۱ گرم سدیم استات را با دقت وزن کنید، در آب حل کنید و به یک فلاسک حجمی ۱۰۰۰ میلی‌لیتری منتقل کنید؛ ۳.۹۵ میلی‌لیتر NaOH ۵۰٪ را با دقت پیپت کنید، با آب فوق خالص تا ۱۰۰۰ میلی‌لیتر رقیق کنید و تحت خلاء فیلتر کنید.
• ۲.۱.۳ محلول اسید سولفوسالیسیلیک ۳٪: ۳.۰ گرم اسید سولفوسالیسیلیک را وزن کنید، در آب حل کنید و تا ۱۰۰ میلی‌لیتر رقیق کنید (تازه آماده شود).
• ۲.۱.۴ محلول مادر استاندارد مخلوط: ۵ میلی‌گرم از هر کدام از ۲'-فوکوزیل لاکتوز، ۳'-فوکوزیل لاکتوز، ۳'-سیالیل لاکتوز، ۶'-سیالیل لاکتوز، لاکتو-ان-تتروز و لاکتو-ان-نئوتتروز را با دقت وزن کنید (تا نزدیکترین ۰.۱ میلی‌گرم)، در یک فلاسک حجمی ۱۰ میلی‌لیتری قرار دهید، در آب حل کنید و تا خط نشانه رقیق کنید تا یک محلول مادر مخلوط ۵۰۰ میلی‌گرم بر لیتر تهیه شود. به طور جداگانه ۱ میلی‌گرم دی فوکوزیل لاکتوز را وزن کنید (تا نزدیکترین ۰.۱ میلی‌گرم)، در یک فلاسک حجمی ۱۰ میلی‌لیتری قرار دهید، حل کنید و تا خط نشانه رقیق کنید تا یک محلول مادر ۱۰۰ میلی‌گرم بر لیتر تهیه شود.
• ۲.۱.۵ محلول‌های کاری استاندارد مخلوط: محلول مادر مخلوط (۲.۱.۴) را با دقت به فلاسک‌های حجمی پیپت کنید و با آب رقیق کنید تا محلول‌های کاری مخلوط ۲'-FL، ۳'-FL، ۳'-SL، ۶'-SL، LNT، LNnT و DFL در غلظت‌های ۰.۵، ۲، ۴، ۶، ۸ و ۱۰ میلی‌گرم بر لیتر تهیه شود. قبل از استفاده تازه آماده شود.

۲.۲ آماده‌سازی نمونه

تقریباً ۲.۰ گرم نمونه را در یک بشر کوچک وزن کنید، کاملاً با ۵۰ میلی‌لیتر آب گرم (حدود ۵۰ درجه سانتی‌گراد) مخلوط کنید، ۴۰ میلی‌لیتر محلول اسید سولفوسالیسیلیک ۳٪ اضافه کنید، به یک فلاسک حجمی منتقل کرده و تا ۱۰۰ میلی‌لیتر رقیق کنید و به مدت ۱۰ دقیقه اولتراسونیک کنید. از کاغذ صافی عبور دهید یا سانتریفیوژ کنید (۱۲۰۰۰ دور در دقیقه، ۱۵ دقیقه). محلول نمونه را از یک ستون SPE RP و سپس از یک فیلتر غشایی آبی ۰.۴۵ میکرومتر عبور دهید؛ ۳ میلی‌لیتر اول را دور بریزید و الوت را برای تجزیه و تحلیل جمع‌آوری کنید. قبل از استفاده، ستون SPE RP را با ۲۰ میلی‌لیتر متانول و سپس ۱۵ میلی‌لیتر آب آماده کنید و به مدت ۳۰ دقیقه متعادل کنید.

۲.۳ شرایط تجربی

۲.۳.۱ شرایط کروماتوگرافی یونی

۳. نتایج

۳.۱ محدوده خطی

یک حجم مناسب از هر محلول کاری استاندارد مخلوط تجزیه و تحلیل شد. محدوده خطی ۰.۵-۱۰ میلی‌گرم بر لیتر بود؛ انحراف بین غلظت‌های اندازه‌گیری شده و اسمی در حد حداکثر انحراف مجاز بود، مقادیر R² بالاتر از ۰.۹۹۹ بودند و همه اجزا خطی بودن خوبی نشان دادند.

جدول ۲. محدوده‌های خطی ترکیبات

شکل ۱. کروماتوگرام‌های کالیبراسیون همپوشانی هفت استاندارد HMO

۳.۲ نتایج آزمایش نمونه

نمونه‌های ۱ و ۲ پس از ۱۰ برابر رقیق‌سازی آزمایش شدند. محتوای هر یک از هفت HMO به شرح زیر محاسبه شد: X محتوا در نمونه (میلی‌گرم بر ۱۰۰ گرم) است؛ c غلظت در محلول نمونه از منحنی کالیبراسیون (میلی‌گرم بر لیتر) است؛ V حجم ثابت (میلی‌لیتر) است؛ m جرم نمونه (گرم) است؛ f ضریب رقیق‌سازی است. محتواهای محاسبه شده (میلی‌گرم بر ۱۰۰ گرم) به شرح زیر است:

شکل ۲. کروماتوگرام یونی نمونه ۱ رقیق شده ۱۰ برابر

شکل ۳. کروماتوگرام یونی نمونه ۲ رقیق شده ۱۰ برابر

جدول ۳. نتایج آزمایش نمونه

۳.۳ دقت

محلول کاری در سطح چهارم کالیبراسیون در شش تزریق متوالی تحت شرایط ۲.۳.۱ تجزیه و تحلیل شد. انحراف معیار نسبی (RSD) محتوای هفت HMO برای ارزیابی تکرارپذیری محاسبه شد. نتایج زیر دقت خوب روش را نشان می‌دهد.

۳.۳.۱ دقت تکرارپذیری استاندارد

نتایج تست:

شکل ۴. کروماتوگرام‌های همپوشانی تزریق‌های تکراری مستقل استاندارد کالیبراسیون S4

جدول ۴. دقت تکرارپذیری استاندارد

۳.۴ حدود تشخیص و کمیت‌سنجی

LOD: حجم‌هایی از محلول استاندارد به یک محلول مخلوط حاوی ۱۰ میکروگرم بر لیتر ۳'-FL، ۳۰ میکروگرم بر لیتر DFL، ۳۰ میکروگرم بر لیتر ۲'-FL، ۲۲ میکروگرم بر لیتر LNnT، ۶۷ میکروگرم بر لیتر LNT، ۶۷ میکروگرم بر لیتر ۶'-SL و ۱۶۰ میکروگرم بر لیتر ۳'-SL رقیق شدند؛ ۲۰ نمونه موازی آماده و تجزیه و تحلیل شدند.

LOQ: حجم‌هایی از محلول استاندارد به یک محلول مخلوط حاوی ۳۰ میکروگرم بر لیتر ۳'-FL، ۸۰ میکروگرم بر لیتر DFL، ۹۰ میکروگرم بر لیتر ۲'-FL، ۶۵ میکروگرم بر لیتر LNnT، ۲۰۰ میکروگرم بر لیتر LNT، ۲۰۰ میکروگرم بر لیتر ۶'-SL و ۵۰۰ میکروگرم بر لیتر ۳'-SL رقیق شدند؛ شش نمونه موازی آماده و تجزیه و تحلیل شدند.

نتایج تست به شرح زیر است:

جدول ۵. نتایج S/N برای LOD و LOQ هفت HMO

۳.۵ ویژگی

حجم‌هایی (هر کدام ۱۰۰ میکرولیتر) از محلول‌های استاندارد گلوکز، فروکتوز، ساکارز و مالتوز در یک فلاسک حجمی ۱۰ میلی‌لیتری اضافه شد و با محلول نمونه ۲ که ۶۷ برابر رقیق شده بود تا خط نشانه رقیق شد. محلول تجزیه و تحلیل شد تا بررسی شود که آیا این قندها با پیک‌های هفت HMO تداخل دارند یا خیر. همانطور که در زیر نشان داده شده است، چهار قند هیچ تداخل قابل توجهی با تعیین هفت HMO در پودر شیر نداشتند.

شکل ۵. کروماتوگرام‌های همپوشانی کالیبراسیون S6، نمونه ۲ و نمونه ۲ اسپایک شده با چهار استاندارد قند

۴. نتیجه‌گیری

این اعتبارسنجی از کروماتوگراف یونی WAYEAL برای تأیید روش تعیین HMOها در غذاها استفاده کرد. داده‌ها نشان می‌دهند که تمام پیک‌های کروماتوگرافی خوش‌شکل و بدون دم‌گیری هستند؛ ۲'-FL، ۳'-FL، DFL، LNnT، LNT، ۶'-SL و ۳'-SL همگی در عرض ۶۰ دقیقه الوت می‌شوند؛ حساسیت الزامات استاندارد ملی را برآورده می‌کند؛ و ضرایب همبستگی خطی همگی بزرگتر از ۰.۹۹۹ هستند. تکرارپذیری استانداردها و نمونه‌ها خوب است. به جز دو سیالیل لاکتوز، LOD و LOQ در سطح میکروگرم بر لیتر هستند. این روش دارای ویژگی خوبی است، بدون ناخالصی تداخل‌کننده یافت شده و در مجموع الزامات استاندارد را برآورده می‌کند.