تعیین افلاتوکسین B1، یک ماده سرطان زا گروه 1، در محصولات روغن دار با استفاده از سیستم Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS

آفلاتوکسین B₁یک متابولیت ثانویه بسیار سمی است که عمدتا توسط آسپرژیلوس فلاووسو آسپرژیلوس پارازیتیکوس. در میان خانواده آفلاتوکسین، قوی ترین سمیت و گسترده ترین توزیع را نشان می دهد. اثرات سمی خود را با مهار سنتز DNA و RNA داخل سلولی و تداخل در متابولیسم پروتئین اعمال می‌کند و اثر مخرب بسیار هدفمندی بر کبد دارد.در مقایسه با سایر مایکوتوکسین ها مانند اکراتوکسین و پاتولین، آفلاتوکسین B₁بسیار سمی است و سرطان زایی آن به خوبی ثابت شده است. به عنوان یک طبقه بندی شده است سرطان زا گروه 1توسط سازمان بهداشت جهانی (WHO). اغلب در محصولات روغن دار مانند بادام زمینی، ذرت، آجیل و روغن های گیاهی شناسایی می شود، که آن را به یک آلاینده اولویت برای کنترل ایمنی مواد غذایی در سراسر جهان تبدیل می کند.

آلودگی به آفلاتوکسین B₁معمولاً زمانی اتفاق می‌افتد که محصولات روغن‌دار در طول کاشت، برداشت یا ذخیره‌سازی در معرض دمای بالا و شرایط رطوبت بالا قرار می‌گیرند که باعث رشد قارچ می‌شود. علاوه بر این، به دلیل خواص شیمیایی پایدار، آفلاتوکسین B₁نمی تواند توسط دمای پخت معمولی از بین برود، که منجر به مشکلات تکراری باقی مانده در محصولات کشاورزی و غذاهای فرآوری شده می شود.

مصرف کوتاه مدت دوز بالا می تواند باعث مسمومیت حاد شود که با علائمی مانند درد شدید شکم، استفراغ، یرقان و نارسایی کبد تظاهر می کند که در موارد شدید ممکن است کشنده باشد. قرار گرفتن در معرض طولانی مدت با دوز کم منجر به تجمع در کبد می شود و باعث آسیب مزمن کبدی مانند فیبروز کبدی و سیروز می شود و حتی ممکن است باعث سرطان اولیه کبد شود. جمعیت هایی که ایمنی پایین تری دارند، از جمله کودکان، افراد مسن، و افراد مبتلا به بیماری های کبدی از قبل، در معرض خطر بالاتری از آفلاتوکسین B هستند.₁مسمومیت

در چین، استاندارد ملی GB 2761-2017 (استاندارد ملی ایمنی غذا - حداکثر سطوح مایکوتوکسین در غذاها) حداکثر حد باقیمانده را برای آفلاتوکسین B مشخص می کند.₁در انواع غذاها علاوه بر این، GB 5009.22-2016 (استاندارد ملی ایمنی مواد غذایی - تعیین آفلاتوکسین های B و G در غذاها)روش های رسمی تحلیلی برای تعیین آفلاتوکسین B ارائه می دهد₁.

این یادداشت کاربردی، ایجاد یک روش کروماتوگرافی مایع رقیق‌سازی ایزوتوپی- طیف‌سنجی جرمی پشت سر هم (LC-MS/MS) را برای تعیین آفلاتوکسین B توصیف می‌کند.₁با استفاده از سیستم Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS.

کلمات کلیدی:چهار قطبی سه گانه; آفلاتوکسین B₁; کروماتوگرافی مایع با رقت ایزوتوپی - طیف سنجی جرمی پشت سر هم.

1. ابزار و معرف ها

1.1 پیکربندی ابزار

جدول 1 فهرست پیکربندی ابزار

1.2 معرف ها و استانداردها

جدول 2 معرف ها و استانداردها

1.3 آزمایش مواد و تجهیزات کمکی

میکسر گرداب

سانتریفیوژ با سرعت بالا

تعادل تحلیلی

سانتریفیوژ

منیفولد استخراج فاز جامد (SPE) (با پمپ خلاء)

اواپراتور نیتروژن

تکان دهنده

2. روش آزمایش

2.1 آماده سازی محلول

2.1.1 5 میلی مول در لیتر محلول استات آمونیوم:0.39 گرم استات آمونیوم را وزن کنید، آن را در آب حل کنید و تا 1000 میلی لیتر رقیق کنید. خوب مخلوط کنید.

2.1.1 محلول متانول-استونیتریل:100 میلی لیتر استونیتریل را به 100 میلی لیتر متانول اضافه کنید، سپس خوب مخلوط کنید.

2.2 پیش تصفیه نمونه

2.2.1 استخراج نمونه

آرد گندم را از الک آزمایشی با دهانه 2 میلی متر رد کنید. 5 گرم از نمونه (با دقت 0.01 گرم) را در یک لوله سانتریفیوژ 50 میلی لیتری وزن کنید. 100 اضافه کنیدμL محلول کار استاندارد داخلی ایزوتوپ (100ng/ml)، با گرداب مخلوط کنید و اجازه دهید به مدت 30 دقیقه بماند. 20 میلی لیتر محلول متانول-آب (70+30، V/V) اضافه کنید، ورتکس کنید تا مخلوط شود و به مدت 20 دقیقه روی یک شیکر اوربیتال تکان دهید. با سرعت 6000r/min به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ کنید. مایع رویی را برای استفاده بعدی جمع آوری کنید.

2.2.2 تصفیه نمونه

4 میلی لیتر از مایع رویی را به طور دقیق به یک ظرف منتقل کنید، 23 میلی لیتر 1٪ Triton X-100 را در PBS اضافه کنید و خوب مخلوط کنید.

پس از تخلیه کامل مایع اصلی در ستون ایمنی، محلول نمونه فوق را به یک بشکه سرنگ 50 میلی لیتری منتقل کنید. سرعت جریان را طوری تنظیم کنید که محلول نمونه به طور پیوسته با سرعت 1-3 میلی لیتر در دقیقه از ستون عبور کند. پس از تخلیه کامل محلول نمونه، 2 × 10 میلی لیتر آب به بشکه سرنگ اضافه کنید و ستون ایمنی را با سرعت جریان ثابت بشویید. پس از تخلیه آب، ستون را با استفاده از پمپ خلاء خشک کنید.

سیستم جاروبرقی را جدا کنید. یک لوله آزمایش مدرج 10 میلی‌لیتری را زیر ستون ایمونوفینیتی قرار دهید، بشکه سرنگ 50 میلی‌لیتری را بردارید و 2 × 1 میلی‌لیتر متانول اضافه کنید تا ستون با سرعت جریان کنترل‌شده 1 تا 3 میلی‌لیتر در دقیقه شسته شود. سپس ستون را دوباره با استفاده از پمپ خلاء خشک کنید. تمام مایع شستشو را در لوله آزمایش جمع آوری کنید.محلول شستشو را به آرامی در زیر جریان نیتروژن در دمای 50 درجه سانتیگراد تا تقریباً خشک شدن تبخیر کنید. 1 میلی لیتر از فاز متحرک اولیه را اضافه کنید، به مدت 30 ثانیه گرداب کنید تا باقیمانده حل شود. از طریق یک فیلتر غشایی 0.22 میکرومتر فیلتر کنید و فیلتر را برای تزریق بعدی در یک ویال نمونه برداری خودکار جمع آوری کنید.

2.3 شرایط آزمایش

2.3.1 روش کروماتوگرافی مایع

ستون: C18, 1.7μمتر، 2.1×50 میلی متر

فاز متحرک: الف: محلول متانول-استونیتریل. فاز B: محلول 5mmol/L استات آمونیوم

سرعت جریان: 0.3 میلی لیتر در دقیقه

دمای ستون: 40درجهسی

حجم تزریق: 3μL

2.3.2 روش طیف سنجی جرمی

جدول 3 پارامترهای طیف سنجی جرمی مرکب

نکته: ستاره (*) یون کمی را نشان می دهد.

3. نتیجه آزمایش

3.1 کروماتوگرام استاندارد

تعیین آفلاتوکسین B₁و استاندارد داخلی ایزوتوپ 13C17- آفلاتوکسین B₁در عرض 5 دقیقه تکمیل شد. همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است، هر دو آنالیت اشکال پیک عالی و پاسخ های رضایت بخشی را نشان دادند که الزامات آنالیز تجربی را برآورده می کند.

شکل 1 کروماتوگرام آفلاتوکسین B₁و استاندارد داخلی ایزوتوپ 13C17را-آفلاتوکسین B₁

3.2 محدوده خطی

حجم مناسبی از محلول استوک استاندارد و محلول کاری استاندارد داخلی مخلوط ایزوتوپ به دقت منتقل و با فاز متحرک اولیه رقیق شد تا یک سری محلول کاری استاندارد با آفلاتوکسین B تهیه شود.₁غلظت های 50، 20، 10، 5، 2، 1 و 0.5 نانوگرم در میلی لیتر. هر محلول حاوی استاندارد داخلی ایزوتوپ با غلظت 2ng/mL بود. منحنی کالیبراسیون با استفاده از این استانداردها ساخته شد. در محدوده خطی 0.5–50ng/ml و پس از اصلاح با استفاده از 13C 17-aflatoxin B₁به عنوان استاندارد داخلی، انحراف بین آفلاتوکسین B اندازه گیری شده و اسمی₁غلظت در حداکثر انحراف مجاز بود. ضریب همبستگی (R) بیشتر از 0.999 بود که نشان دهنده خطی بودن عالی است.

شکل 2 منحنی استاندارد آفلاتوکسین B₁

3.3 تکرارپذیری

محلول های استاندارد در سه غلظت (1، 10 و 20 نانوگرم در میلی لیتر) شش بار متوالی تزریق شد. نتایج در جدول زیر نشان داده شده است. انحراف استاندارد نسبی (RSDs) زمان نگهداری و مقادیر نمونه برای آفلاتوکسین B₁در غلظت‌های کم، متوسط ​​و بالا همگی در محدوده 5 درصد بودند که نیازهای آزمایش را برآورده کردند.

جدول 4 تست تکرارپذیری آفلاتوکسین B₁در غلظت های کم، متوسط ​​و بالا

3.4 بازیابی اسپایک

آفلاتوکسین B₁محلول استاندارد برای دستیابی به غلظت نهایی 5 نانوگرم در میلی لیتر به داخل نمونه ریخته شد. نمونه مشخص شده سپس توسط LC-MS/MS آنالیز شد. میانگین نتیجه از شش تزریق متوالی 5.147 نانوگرم در میلی لیتر، با RSD 1.954٪ بود. نرخ بازیابی محاسبه شده 102.94٪ بود که الزامات آزمایش را برآورده می کند.

3.5 باقیمانده خالی

پس از تزریق مداوم محلول استاندارد 20 نانوگرم بر میلی‌لیتر، سپس یک نمونه خالی برای ارزیابی انتقال تزریق شد. همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است، هیچ انتقالی در نمونه خالی مشاهده نشد.

شکل 3 کروماتوگرام خالی ترکیب

3.6 نمونه آزمون

آفلاتوکسین B₁در نمونه A (شکل 4) شناسایی نشد.

شکل 4 کروماتوگرام آفلاتوکسین B₁در نمونه A

4. نتیجه گیری

در این مطالعه، روش کروماتوگرافی مایع رقیق‌سازی ایزوتوپی- طیف‌سنجی جرمی پشت سر هم (LC-MS/MS) برای تعیین آفلاتوکسین B.₁با استفاده از سیستم طیف‌سنجی جرمی کروماتوگرافی مایع Wayeal LCMS-TQ9200 ایجاد شد. داده‌های به‌دست‌آمده نشان می‌دهد که تمام قله‌های کروماتوگرافی شکل قله‌های خوبی را بدون دم نشان می‌دهند. حساسیت الزامات تجربی را برآورده می کند و ضریب همبستگی (R) بزرگتر از 0.999 است که معیارهای خطی بودن را برآورده می کند. تکرارپذیری در غلظت های کم، متوسط ​​و بالا در محدوده 5 درصد است و هیچ انتقالی در سیستم پس از تزریق نمونه با غلظت بالا مشاهده نمی شود. این نتایج نشان می‌دهد که روش، هنگامی که به سیستم طیف‌سنجی جرمی کروماتوگرافی مایع Wayeal مجهز شود، الزامات آنالیز کمی و کیفی معمول نمونه‌های هدف را برآورده می‌کند.