تعیین باقیمانده‌های β-آگونیست در گوشت خوک با استفاده از سیستم کروماتوگرافی مایع-طیف‌سنجی جرمی متوالی Wayeal LCMS-TQ9200

این آزمایش به "GB 31658" اشاره دارد.22-2022 National Food Safety Standard — Determination of β-Agonist Residues in Animal-Derived Foods by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry" and utilizes the Wayeal LCMS-TQ9200 liquid chromatography-tandem mass spectrometry system to determine the content of β-agonists in porkنتایج تجربی نشان می دهد که آزمایش مناسب سیستم نشان می دهد که قله های خوب شکل و خطی خوب، نیازهای تجربی را برآورده می کند.تکرار زمان حفظ برای محلول کار استاندارد β-agonist کمتر از 1٪ بود.برای محلول آزمایش حساسیت از β-agonists، نسبت سیگنال به سر و صدا از قله های اصلی در غلظت 0.2ng/mL و 0.5ng/mL به طور قابل توجهی بیشتر از 3 و 10 به ترتیب بودند و الزامات تجربی را برآورده می کردند.

در آزمایش نمونه گوشت خوک هیچ بیتاگونستی شناسایی نشد. تمام داده های بالا مطابق با الزامات ابزار مشخص شده توسط روش استاندارد است..

کلمات کلیدی:کروماتوگرافی مایع - طیف سنجی تاندمی جرم؛ β-agonists؛ Clenbuterol؛ ایمنی مواد غذایی.

1ابزارها و عوامل

1.1 فهرست پیکربندی LCMS

جدول 1 فهرست پیکربندی ابزار

1.2 واکنش ها و استانداردها

جدول ۲: فهرست عوامل و استانداردها

1.3 مواد آزمایشی و تجهیزات کمکی

پاک کننده فوق صوتي

مخلوط کننده گرد و غبار

حمام آب با دمای ثابت

سانتریفیوژ با سرعت بالا

2روش تجربی

2.1 قبل از درمان نمونه

2.1.1 هیدرولیز و استخراج آنزیمی

2g از نمونه (با دقت ±0.05g) را در یک لوله سانتریفیوژ 50mL وزن کنید. 6mL از 0.2mol/L آمونیوم استات محلول بافر و 40μL β-گلوکورونیداز/آریل سولفاتاز اضافه کنید. گرد و غبار برای مخلوط کاملو در 37 درجه سانتیگراد در تاریکی با تکان دادن در حمام آب برای 16 ساعت تکان دهید.اجازه دهید تا به دمای اتاق برای استفاده بعدی خنک شود.

2.1.2 استخراج، تصفیه و غلظت

محلول آماده شده را بگیرید، 100μL از محلول کار استاندارد داخلی 100ng / ml اضافه کنید، گرد و غبار را به طور کامل مخلوط کنید و در 8000r / min برای 8 دقیقه سانتریفیوژ کنید.1mol/L محلول اسید پرکلوریک، گرد و غبار برای مخلوط کردن و تنظیم pH به 1.0 ± 0.2 با استفاده از اسید پرکلوریک. پس از سانتریفیوژ در 8000r/min برای 8 دقیقه، تنظیم pH supernatant به 10 ± 0.5 با استفاده از محلول هیدروکسید سدیم 10mol/L. 15mL از استات اتیل اضافه کنید، با سرعت متوسط برای 5 دقیقه تکان دهید و در 5000r / min برای 5 دقیقه سانتریفیوژ کنید. لایه ارگانیک بالایی را جمع آوری کنید. به لایه آب باقی مانده،10 میلی لیتر ترت-بوتیل متیل اتر اضافه کنید، با سرعت متوسط برای 5 دقیقه تکان داده شود، با سرعت 5000r/min برای 5 دقیقه سانتریفیوژ شود و لایه ی ارگانیک بالایی جمع آوری شود. تمام لایه های ارگانیک ترکیب شوند و در زیر یک جریان نیتروژن در 50°C تا خشکی تبخیر شوند.باقیمانده را در 5 میلی لیتر محلول 2٪ اسید فورمیک حل کنید و کنار بگذارید.. یک ستون استخراج فاز جامد با مبادله کتیون حالت مخلوط را با فعال کردن آن به صورت متوالی با 3 میلی لیتر متانول و 3 میلی لیتر اسید فورمیک 2٪ آماده کنید. محلول آماده شده را روی ستون بارگذاری کنید.به صورت متوالی با 3 میلی لیتر اسید فورمیک 2٪ و 3 میلی لیتر متانول بشویید، و در خلاء خشک کنید. ستون را با 3 ملی لیتر محلول 5٪ متانول آمونی شده الوز کنید. الوز را تا خشکی در زیر یک جریان نیتروژن در 50 ° C تبخیر دهید. باقی مانده را در 0.5 ملی لیتر متانول دوباره حل کنید.محلول ۱٪ اسید مورچه (10:90، v/v) ، به خوبی مخلوط شود و از طریق یک غشای میکروپوری 0.22μm برای تجزیه و تحلیل توسط کروماتوگرافی مایع-تندم طیف سنجی جرم فیلتر شود.

2.2 شرایط آزمایش

2.2.1 شرایط کروماتوگرافی مایع

ستون کروماتوگرافی C18, 1.8μm 2.1*100mm

فاز متحرک: A: 0.1٪ اسید فورمیک در آب؛ B: متانول

سرعت جریان: 0.3 میلی لیتر/ دقیقه

دمای ستون: 40°C

حجم تزریق: 3μL

3.بررسی مناسب سیستم

آزمایش مناسب سیستم نشان می دهد که قله های هدف بدون دخالت دیگر قله های ناخالصی، شکل خوبی دارند و الزامات تجربی را برآورده می کنند.

شکل 1 کروماتوگرافی از آزمایش هفت β-agonist (1ng/mL)

3.2 محدوده خطی

با استفاده از محلول های استاندارد β-agonist و با استفاده از محلول های کارگری غلظت متوسط، یک منحنی استاندارد به صورت مرحله ای تهیه شد. محدوده خطی برای هفت β-agonist 0.550ng / ml بود.با R2 > 0.99، که نشان دهنده رابطه خطی خوبی است.

جدول 3 جدول محدوده خطی برای β-agonists

شکل 2 کروماتوگرافی منحنی استاندارد هفت β-agonist

3.3 حد تشخیص (LOD) و حد کمی (LOQ)

در این روش، حد تشخیص (LOD) و حد کمی (LOQ) برای β-agonists به ترتیب در 0.2ng/mL و 0.5ng/mL تنظیم شده است.نسبت سیگنال به سر و صدا در غلظت های مشخص شده برای LOD و LOQ بیشتر از 3 و 10 است، به ترتیب، پاسخ به الزامات حساسیت تجربی.

جدول ۴ نسبت سیگنال به سر و صدا برای LOD و LOQ هر ترکیب

شکل 3 کروماتوگرافی یون هفت β-agonist در غلظت LOD و LOQ

3.4 آزمون دقت

یک محلول مخلوط از مواد استاندارد β-agonist در غلظت های پایین، متوسط و بالا گرفته شد و شش بار متوالی تزریق شد تا زمان حفظ و انحرافات منطقه اوج را مقایسه کند.نتایج در جدول زیر نشان داده شده استتمام β-agonists انحرافات زمان حفظ کمتر از 1٪ و انحرافات منطقه اوج کمتر از 3٪ را نشان دادند که نیازهای تجربی را برآورده می کند.

جدول 5 آزمایش دقیق برای هر ترکیب

شکل ۴: کروماتوگرافی دقیق آزمایش هفت β-agonist (6 تزریق)

3.5 آزمایش نمونه

نمونه های گوشت خوک خریداری شده از بازار با استفاده از روش قبل از درمان ذکر شده آزمایش شدند و هیچ β-agonist شناسایی نشد.هیچ اوج کروماتوگرافیکی در زمان های نگهداری مربوط به هفت β-agonist مشاهده نشد.، در حالی که قله های دیگر نشان دهنده سیگنال های ماتریس پس از هیدرولیز آنزیمی است.

شکل 5 کروماتوگرافی آزمایش نمونه گوشت خوک

4نتیجه گیری

این روش از سیستم طیف سنجی تاندمی کروماتوگرافی مایع Wayeal LCMS-TQ9200 برای تعیین β-agonists در گوشت خوک استفاده می کند.داده ها نشان می دهد که تمام قله های کروماتوگرافی شکل خوبی را بدون دم نشان می دهند، حساسیت با الزامات تجربی مطابقت دارد، ضریب همبستگی خطی بیش از 0 است.99، و دقت با انحرافات زمان حفظ کمتر از 1٪ و انحرافات منطقه اوج در حدود 3٪ برای شش تزریق متوالی از هر ترکیب رضایت بخش است.در آزمایشات نمونه گوشت خوک، هیچ پادتن β-agonist شناسایی نشداین نتایج نشان می دهد که روش مجهز به سیستم Wayeal LC-MS/MS، الزامات تشخیص کیفی و کمی معمول را برای تحلیلگرهای هدف برآورده می کند.