تعیین بقایای آنتی بیوتیک آمفنیکول در گوشت مرغ با Wayeal LCMS-TQ9200

کلمات کلیدی: LCMS، آمفنیکل، ایمنی مواد غذایی، باقیمانده های دارویی دامی.

1. ابزار و معرف ها

1.1 لیست پیکربندی LCMS

جدول 1 لیست پیکربندی ابزار

1.3 مواد آزمایش و تجهیزات کمکی

تمیزکننده اولتراسونیک

میکسر ورتکس

تبخیرکننده نیتروژن حمام آب

سانتریفیوژ با سرعت بالا

2. روش های آزمایش

2.1 تهیه محلول

2.1.1 محلول اتیل استات آمونیاکی 2%: 4 میلی لیتر آب آمونیاک را برداشته و با اتیل استات به 200 میلی لیتر رقیق کنید.

2.1.2 محلول سدیم کلرید 4%: 4 گرم سدیم کلرید برداشته، در آب حل کرده و به 100 میلی لیتر رقیق کنید.

2.1.3 محلول n-هگزان اشباع شده با سدیم کلرید 4%: مقدار مناسبی از محلول سدیم کلرید 4% را برداشته، مقدار اضافی n-هگزان اضافه کنید، مخلوط کنید، اجازه دهید لایه ها جدا شوند و لایه بالایی n-هگزان را بردارید.

2.1.4 محلول کاری استاندارد داخلی مخلوط: مقدار مناسبی از محلول ذخیره استاندارد داخلی مخلوط را برداشته، با 20% متانول رقیق کنید تا کلرامفنیکل-D5 در 10 نانوگرم در میلی لیتر و سایر استانداردهای داخلی (فلورفنیکل-D3، تیامفنیکل-D3 و فلورفنیکل آمین-D3) در هر کدام 50 نانوگرم در میلی لیتر به دست آید.

2.2 پیش تیمار نمونه

2.2.1 استخراج نمونه: 2 گرم نمونه (با دقت ±0.01 گرم) وزن کنید، 100 میکرولیتر محلول کاری استاندارد داخلی مخلوط اضافه کنید، به مدت 1 دقیقه ورتکس کنید، 10 میلی لیتر محلول اتیل استات آمونیاکی 2% اضافه کنید، به مدت 10 دقیقه ورتکس کنید، در 8000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ کنید و سوپرناتانت را جمع آوری کنید. 10 میلی لیتر دیگر از محلول اتیل استات آمونیاکی 2% به باقیمانده اضافه کنید و روش استخراج را تکرار کنید. دو سوپرناتانت را ترکیب کنید، تحت جریان نیتروژن در دمای 50 درجه سانتیگراد تا خشکی تبخیر کنید و برای استفاده ذخیره کنید.

2.2.2 خالص سازی نمونه: 3 میلی لیتر محلول سدیم کلرید 4% به باقیمانده خالص سازی اضافه کنید، برای حل شدن ورتکس کنید، سپس 5 میلی لیتر محلول n-هگزان اشباع شده با سدیم کلرید 4% اضافه کنید، به مدت 30 ثانیه ورتکس کنید، در 8000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ کنید و لایه بالایی n-هگزان را دور بریزید. روش چربی زدایی را یک بار تکرار کنید. 5 میلی لیتر محلول اتیل استات آمونیاکی 2% اضافه کنید، به مدت 10 دقیقه ورتکس کنید، در 8000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ کنید و سوپرناتانت را جمع آوری کنید. 5 میلی لیتر دیگر از محلول اتیل استات آمونیاکی 2% به باقیمانده اضافه کنید و روش استخراج را تکرار کنید. سوپرناتانت ها را ترکیب کنید، تحت جریان نیتروژن در دمای 50 درجه سانتیگراد تا خشکی تبخیر کنید، 1 میلی لیتر محلول متانول 20% اضافه کنید، به مدت 30 ثانیه ورتکس کنید، از طریق غشا فیلتر کنید و منتظر تجزیه و تحلیل ابزاری باشید.

2.3 شرایط آزمایش

2.3.1 شرایط کروماتوگرافی مایع

ستون کروماتوگرافی: C18 1.7 میکرومتر 2.1x50mm

فاز متحرک: A: استونیتریل؛ B: 2 میلی مولار فرمات آمونیوم در آب

سرعت جریان: 0.3 میلی لیتر در دقیقه

دمای ستون: 40 درجه سانتیگراد

حجم تزریق: 5 میکرولیتر

2.3.2 شرایط طیف سنجی جرمی

جدول 3 پارامترهای منبع یون

3. نتیجه آزمایش

3.1 کروماتوگرام استاندارد

تعیین چهار آنتی بیوتیک آمیدی و استانداردهای داخلی آنها در عرض 6 دقیقه تکمیل شد. همه پیک ها شکل پیک خوبی را بدون دم نشان دادند و هر ترکیب پاسخ رضایت بخشی را نشان داد که الزامات آزمایش را برآورده می کرد.

شکل 1 کروماتوگرام 4 آنتی بیوتیک آمفنیکل و استاندارد داخلی (کلرامفنیکل 0.2 نانوگرم در میلی لیتر، سایر آنتی بیوتیک ها 1 نانوگرم در میلی لیتر)

3.2 محدوده خطی

مقدار مناسبی از محلول استاندارد مخلوط الکل آمیدی را برداشته و به صورت پله ای به یک سری غلظت ها رقیق کنید تا یک منحنی استاندارد تهیه شود. از روش استاندارد داخلی ایزوتوپ برای تجزیه و تحلیل کمی استفاده شد. محدوده خطی برای کلرامفنیکل 0.2-10 نانوگرم در میلی لیتر و برای فلورفنیکل آمین، تیامفنیکل و فلورفنیکل 1-50 نانوگرم در میلی لیتر بود. انحراف بین نتایج تشخیص خطی و غلظت های شناخته شده کمتر از حداکثر انحراف مجاز بود، با مقادیر R² از 0.9958 تا 0.9998، که نشان دهنده خطی بودن عالی برای همه اجزا است.

جدول 4 محدوده خطی ترکیبات

شکل 2 داده های منحنی کالیبراسیون چهار ترکیب

3.3 LOD و LOQ

استاندارد ملی ایمنی مواد غذایی چین GB 31658.20-2022 مشخص می کند که برای این روش، حد تشخیص (LOD) برای کلرامفنیکل 0.1 میکروگرم در کیلوگرم و حد کمی (LOQ) 0.2 میکروگرم در کیلوگرم است. در حالی که برای تیامفنیکل، فلورفنیکل و فلورفنیکل آمین، LOD 0.5 میکروگرم در کیلوگرم و LOQ 1 میکروگرم در کیلوگرم است. نسبت سیگنال به نویز برای همه ترکیبات هدف در غلظت های مشخص شده حد تشخیص (LOD) و حد کمی (LOQ) به طور قابل توجهی بیشتر از 3 و 10 است که با الزامات حساسیت مشخص شده در استاندارد ملی مطابقت دارد.

جدول 5 حدود تشخیص و کمی سازی برای هر ترکیب

شکل 3 کروماتوگرام های حدود تشخیص و حدود کمی سازی برای چهار ترکیب

3.4 تست دقت

غلظت های کم، متوسط و زیاد مخلوط استاندارد آمفنیکل را برداشته و شش تزریق متوالی انجام دهید تا انحرافات در زمان ماندگاری و مساحت پیک مقایسه شود. نتایج در جدول زیر نشان داده شده است. انحرافات زمان ماندگاری همه ترکیبات آمفنیکل کمتر از 1٪ و انحرافات مساحت پیک کمتر از 5٪ بود که الزامات دقت RSD ≤ 15٪ مشخص شده توسط استاندارد ملی را برآورده می کرد.

جدول 6 تست دقت برای هر ترکیب

شکل 4 کروماتوگرام های دقت چهار ترکیب الکل آمیدی

3.5 تست بازیابی اسپایک ماتریس

دقت این روش تشخیص با استفاده از تست بازیابی اسپایک ارزیابی شد. غلظت های شناخته شده نمونه های استاندارد را به نمونه ماتریس خالی با نسبت های مختلف اضافه کنید تا نمونه های اسپایک شده ماتریس در غلظت های بالا، متوسط و کم تهیه شود. هر سطح غلظت نمونه های اسپایک شده به طور مستقل شش بار تجزیه و تحلیل شد. میزان بازیابی با مقایسه غلظت تشخیص داده شده در ماتریس قبل و بعد از اسپایک محاسبه شد و در نتیجه دقت روش ارزیابی شد. نتایج به شرح زیر است: در ماتریس مرغ، میزان بازیابی اسپایک همه ترکیبات از 94.5٪ تا 107.2٪ متغیر بود، با CV در 5٪، که نشان می دهد دقت الزامات روش را برآورده می کند.

جدول 6 میزان بازیابی ترکیبات در ماتریس مرغ اسپایک شده

3.6 تست نمونه

نمونه های سینه مرغ خریداری شده به طور تصادفی از سوپرمارکت ها با استفاده از روش پیش تیمار نمونه فوق الذکر استخراج و خالص شدند. پس از آزمایش نمونه ها بر روی دستگاه، هیچ یک از چهار آنتی بیوتیک آمیدی شناسایی نشد.

شکل 5 کروماتوگرام چهار ترکیب الکل آمیدی در نمونه های سینه مرغ سوپرمارکت

4. نتیجه گیری

این روش از سیستم طیف سنجی جرمی کروماتوگرافی مایع Wayeal LCMS-TQ9200 برای تعیین آنتی بیوتیک های آمفنیکل در مواد غذایی مشتق شده از حیوانات استفاده می کند و امکان دستیابی همزمان به ترکیبات را در هر دو حالت یون مثبت و منفی فراهم می کند. داده ها نشان می دهد که این روش پیک های کروماتوگرافی با شکل خوب را بدون دم ارائه می دهد و حساسیت آن الزامات استاندارد ملی را برآورده می کند. ضرایب همبستگی خطی همگی بیشتر از 0.99 هستند. انحراف زمان ماندگاری برای همه ترکیبات در شش تزریق متوالی در 1٪ و انحراف مساحت پیک در 5٪ است که دقت خوبی را نشان می دهد. میزان بازیابی اسپایک شده در ماتریس مرغ از 94.5٪ تا 107.2٪ متغیر است، با CV در 5٪، که نشان می دهد دقت الزامات روش شناختی را برآورده می کند. نمونه های سینه مرغ خریداری شده به طور تصادفی از سوپرمارکت ها تجزیه و تحلیل شدند و هیچ یک از چهار آنتی بیوتیک آمفنیکل شناسایی نشد. این نشان می دهد که این روش، مجهز به سیستم طیف سنجی جرمی کروماتوگرافی مایع Wayeal، الزامات تشخیص کیفی و کمی معمول نمونه های هدف را برآورده می کند.