تعیین محتوای کافئین در نوشیدنی ها با کروماتوگرافی مایع

کافئین یک آلکالوئید طبیعی متیلکسانتین است که به طور گسترده در مواد خام مانند دانه های قهوه، برگ های چای و دانه های کاکائو وجود دارد.به عنوان یک افزودنی کاربردی اصلی و ترکیب طعم مشخص در نوشیدنی های موجود در بازار استفاده می شودمصرف معتدل کافئین می تواند اثرات فیزیولوژیکی مانند خنک کردن ذهن و کاهش خستگی را داشته باشد.با این حالمصرف بیش از حد و طولانی مدت ممکن است به راحتی واکنش های جانبی از جمله ضربان قلب، بی خوابی و فرط تحریک عصبی را ایجاد کند.کودکان، و افراد مبتلا به بیماری های قلبی عروقی حتی محدودیت های تحمل کمتری دارند.استانداردهای ایمنی مواد غذایی در کشورهای مختلف محدودیت های نظارتی مشخصی را برای محتوای کافئین در نوشیدنی ها تعیین کرده اند.

در چین، استاندارد ملی ایمنی مواد غذایی با عنوان "تعین کافئین در نوشیدنی ها" (GB 5009.139-2014) به عنوان مبنای قانونی برای تعیین کمی کافئین در ماتریسهای نوشیدنی استفاده می شود.کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) ، به دلیل وضوح عالی آن، توانایی قوی در مقاومت در برابر تداخل ماتریس و دقت کمی بالا،روش مورد نظر برای تجزیه و تحلیل نمونه های متریکس پیچیده شده است.، از جمله نوشیدنی های مختلف ترکیبی، نوشیدنی های حاوی شیر و نوشیدنی های گیاهی کاربردی.این آزمایش مطابق با روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا که در استاندارد ملی GB 5009 مشخص شده است انجام شده است..139-2014، که یک پروتکل پیش پردازش نمونه و جداسازی و تشخیص کروماتوگرافی مایع برای نمونه های نوشیدنی را ایجاد می کند،و انجام شناسایی کیفی و تحلیل کمی کافئین در انواع مختلف نوشیدنی ها.

کلمات کلیدی: کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا کافئین نوشیدنی تعیین محتوا

1ابزار و عوامل

1.1 لیست پیکربندی سیستم کروماتوگرافی مایع

جدول ۱: فهرست پیکربندی ابزار

1.2 فهرست عوامل و استانداردها

جدول ۲: فهرست عوامل و استانداردها

1.3 مواد آزمایشی و تجهیزات کمکی

پاک کننده فوق صوتی؛

مخلوط کننده گرد و غبار؛

0.45μm غشای فیلتر فاز آبی میکروپوروس.

2روش تجربی

2.1 آماده سازی راه حل های استاندارد

2.1.1 محلول ذخیره استاندارد کافئین (2.0mg/mL): 20mg از استاندارد مرجع کافئین را با دقت (به نزدیک ترین 0.1mg) در یک بالش 10mL حجم سنج وزن کنید، آن را حل کنید و با متانول به حجم خود اضافه کنید.در یخچال نگه دارید°ج. مدت نگهداری 6 ماه است.

2.1.2 محلول متوسط استاندارد کافئین (200μg/mL): با دقت 5.0mL از محلول استاندارد کافئین را انتقال دهید (2.1.1) به یک بالش 50 میلی لیتری اضافه کنید و آن را با آب به حجم خود اضافه کنید.°ج. مدت نگهداری یک ماه است.

2.1.3 راه حل های کار استاندارد کافئین برای منحنی کالیبراسیون: انتقال 0.5 میلی لیتر، 1.0 میلی لیتر، 2.0 میلی لیتر، 5.0 میلی لیتر و 10.0 میلی لیتر راه حل متوسط استاندارد کافئین (2.1.2) به کلبه های 10 میلی لیتری مجزا تبدیل شده و با آب تا حجم کامل شده است. غلظت حاصل از این سری استاندارد 10 است.0μ20 گرم در میلی لیتر0μ40 گرم در میلی لیتر0μg/mL، 100μg/ml و 200μبه ترتیب، g/mL. بلافاصله قبل از استفاده آماده کنید.

2.2 پیش پردازش نمونه

2.2.1 نوشیدنی های کولا

(الف) از گاز: نمونه را با استفاده از یک پاک کننده فوق صوتی در 40°C برای 5 دقیقه

ب) تصفیه: 5g از نمونه را وزن کنید (با دقت 0.001g) ، به یک بطری 5 میلی لیتر منتقل کنید.و با آب به حجم اضافه کنید (تا اطمینان حاصل شود که محتوای کافئین در محلول نمونه در محدوده منحنی کالیبراسیون قرار دارد). به دقت مخلوط کنید. 0.5g از اکسید منیزیم اضافه کنید، به خوبی تکان دهید و بگذارید بایستد. سوپرناتنت را بردارید و آن را از طریق یک غشای میکروپوروس برای تجزیه و تحلیل بعدی فیلتر کنید.

2.2.2 محصولات قهوه و چای مایع حاوی شیر

1g از نمونه را وزن کنید (با دقت 0.001g) ، به یک کوسه حجم 10 میلی لیتر منتقل کنید.و با محلول اسید تریکلورو اکتیک (با اطمینان از اینکه محتوای کافئین در محلول نمونه در محدوده منحنی کالیبراسیون قرار دارد) به حجم اضافه شود. به خوبی مخلوط کنید و اجازه دهید تا پروتئین سقوط کند. سوپرناتنت را بردارید و آن را از طریق یک غشای میکروپوروس برای تجزیه و تحلیل بعدی فیلتر کنید.

2.3 شرایط آزمایش

2.3.1 شرایط کروماتوگرافی

ستون: C18، 4.6×250 میلیمتر، 5μm

فاز متحرک: متانول/آب = 24/76 (v/v)

سرعت جریان: 1.0 میلی لیتر/ دقیقه

دمای ستون: 25°C

طول موج شناسایی: 272nm

حجم تزریق: 10μL

3نتیجه آزمایش

3.1 خالی

شکل ۱. کروماتوگرام محلول خالی

3.2 محدوده خطی

شکل ۲. نتایج خطی استاندارد مرجع کافئین

جدول ۳: محدوده خطی استاندارد مرجع کافئین

3.3 تکرار

شکل ۳. کروماتوگرام تکرار پذیری استاندارد مرجع کافئین (n = 6)

جدول ۴: پارامترهای کروماتوگرافی تکرار پذیری برای استاندارد مرجع کافئین (n = 6)

3.4 نمونه

شکل ۴. کروماتوم نمونه ای از نوشیدنی های کولا

جدول ۵. نتایج کروماتوگرافی برای یک نمونه خاص از نوشیدنی های کولا

شکل ۵. کروماتوگرام یک نمونه از نوشیدنی چای شیر

جدول ۶. نتایج کروماتوگرافی برای یک نمونه خاص از نوشیدنی چای شیر

3.5 بازیافت افزایش

شکل ۶. کروماتگرام بازیابی اسپایکنگ برای یک نمونه نوشیدنی مخصوص مارک کولا (تکان اسپایکنگ: ۴۰)μg/mL)

جدول ۷. نتایج کروماتوگرافی برای بازیابی Spiking در یک نمونه نوشیدنی مخصوص مارک Cola (تکان Spiking: 40μg/mL)

شکل ۷. کروماتوگرام بازیابی اسپایکنگ برای یک نمونه خاص از نوشیدنی چای شیر (تکان اسپایکنگ: ۴۰μg/ml)

جدول ۸. نتایج کروماتوگرافی برای بازیابی Spiking در یک مارک خاص از نمونه نوشیدنی چای شیر (تکان Spiking: 40μg/mL)

3.6 حد تشخیص

شکل ۸. کروماتوگرام برای محدوده تشخیص یک نمونه نوشیدنی کولا خاص

جدول ۹. نتایج کروماتوگرافی برای محدوده تشخیص یک نمونه خاص از نوشیدنی کولا

شکل ۹. کروماتوگرام برای محدوده تشخیص یک مارک خاص از نمونه نوشیدنی چای شیر

جدول ۱۰. نتایج کروماتوگرافی برای محدوده تشخیص یک مارک خاص از نمونه نوشیدنی چای شیر

4نتیجه گیری

این آزمایش مطابق با GB 5009.139-2014 "استانداردهای ملی ایمنی مواد غذایی" انجام شده است.️تعیین کافئین در نوشیدنی ها، با استفاده از سیستم کروماتوگرافی مایع Wayeal LC3500 مجهز به آشکارساز دیود (DAD) برای تعیین کافئین در نمونه های نوشیدنی.داده های تجربی نشان داد که قله هدف نشان دهنده یک شکل تقارن با تعداد بالای صفحه نظری است.منحنی کالیبراسیون برای سری محلول استاندارد در محدوده غلظت 100μاز 200 گرم در میلی لیتر0μg/mL یک ضریب همبستگی خطی بزرگتر از 0 نشان داد.9999این روش تکرار پذیری بسیار خوبی را نشان داد، با مقادیر RSD برای هر دو زمان حفظ و منطقه اوج کمتر از 0.3٪، نشان دهنده دقت ابزار خوب است.️کولا و چای شیر️آزمایش شد. محتوای کافئین آنها به ترتیب 95.051mg/kg و 260.0456mg/kg تعیین شد. بازیافت افزایش بیش از 94٪ بود که نشان دهنده بهره وری بالا است،از دست دادن نمونه های ناچیز، و یک روش قبل از درمان پایدار و قابل اعتماد. محدودیت های تشخیص (LOD) برای نوشیدنی های نوع کولا 0.0446mg/kg و 0.75mg/kg برای نوشیدنی های چای حاوی شیر بود.نشان دهنده حساسیت بالا و سر و صدای پایین در خط ابتدایی ابزار.