تعیین باقیمانده‌های اریترومایسین در پسماندهای تخمیر آنتی‌بیوتیکی با استفاده از سیستم کروماتوگرافی مایع- طیف‌سنجی جرمی Wayeal LCMS-TQ9200

اریترومایسین یک آنتی‌بیوتیک ماکرولید است که از تخمیر استرپتومایسس اریترئوس تولید می‌شود. اثر ضد باکتریایی آن عمدتاً با مهار سنتز پروتئین باکتریایی اعمال می‌شود. تولید اریترومایسین در درجه اول به فناوری تخمیر زیستی متکی است که شامل مراحلی مانند انتخاب سویه، کشت بذر، تخمیر در مقیاس بزرگ در مخازن، استخراج و خالص‌سازی است. پس از تخمیر، اریترومایسین با حلال‌های آلی (مانند بوتیل استات) استخراج می‌شود و پس از آن با کریستالیزاسیون یا جداسازی رزین تبادل یونی خالص‌سازی می‌شود و در نهایت نمک‌های درجه بالینی (به عنوان مثال، اتیل‌سوکسینات اریترومایسین) به دست می‌آید. با این حال، فرآیند تولید اریترومایسین مقدار قابل توجهی از تفاله میسلی (باقیمانده تخمیر) تولید می‌کند که ممکن است حاوی آنتی‌بیوتیک‌های باقیمانده، پروتئین‌های میکروبی و محصولات جانبی متابولیک باشد. اگر این باقیمانده‌ها به درستی مدیریت نشوند، ممکن است از طریق تخلیه محیطی یا استفاده به عنوان افزودنی‌های خوراک وارد زنجیره اکولوژیکی شوند و منجر به خطرات متعددی شوند: اریترومایسین باقیمانده می‌تواند گسترش ژن‌های مقاومت به آنتی‌بیوتیک را در خاک و آب‌ها افزایش داده و تعادل جوامع میکروبی را مختل کند. از طریق زنجیره غذایی تقویت شده، ممکن است باعث ظهور سویه‌های باکتریایی مقاوم در حیوانات یا انسان شود و اثربخشی آنتی‌بیوتیک را تضعیف کند. علاوه بر این، مواد آلی استفاده نشده در باقیمانده‌ها می‌تواند باعث آلودگی محیط زیست شود. بنابراین، مقررات سختگیرانه باقیمانده میسلی یک اقدام حیاتی برای کنترل آلودگی ناشی از تولید اریترومایسین است.

این آزمایش با استناد به استاندارد "T/PIAC 00003—2021 استاندارد گروه انجمن صنایع دارویی چین - روش تعیین اریترومایسین در باقیمانده آنتی‌بیوتیک، مواد پایه کود آلی، محصولات زراعی و محیط زیست" انجام شد و از سیستم کروماتوگرافی مایع-طیف‌سنجی جرمی Wayeal LCMS-TQ9200 برای تعیین میزان اریترومایسین در تفاله میسلی استفاده شد. نتایج آزمایش نشان می‌دهد که آزمایش مناسب بودن سیستم، شکل پیک خوب و خطی بودن خوبی را نشان داد و الزامات آزمایش را برآورده کرد.

1. ابزار و معرف‌ها

1.1 لیست پیکربندی LCMS

جدول 1 لیست پیکربندی ابزار

1.2 معرف‌ها و استانداردها

جدول 2 لیست معرف‌ها و استانداردها

1.3 مواد آزمایشگاهی و تجهیزات کمکی

تمیزکننده اولتراسونیک

میکسر ورتکس

سانتریفیوژ با سرعت بالا

2. روش آزمایش

2.1 پیش‌تیمار نمونه

0.5 گرم از نمونه را (با دقت 0.001 گرم) در یک لوله آزمایش با درپوش شیشه‌ای وزن کنید. 50 میلی‌لیتر استونیتریل اضافه کنید، به مدت 1 دقیقه ورتکس کنید تا مخلوط همگن شود و به مدت 20 دقیقه استخراج با کمک اولتراسونیک انجام دهید. سپس مخلوط را به یک لوله سانتریفیوژ 50 میلی‌لیتری منتقل کرده و به مدت 10 دقیقه با سرعت 4000 دور در دقیقه سانتریفیوژ کنید. مقدار مناسبی از سوپرناتانت را جمع‌آوری کرده و از یک غشای فیلتر 0.22 میکرومتر عبور دهید. حداقل 1 میلی‌لیتر از فیلتر اولیه را دور بریزید، سپس فیلتر باقیمانده را به یک ویال LC کهربایی برای تجزیه و تحلیل منتقل کنید.

2.2 شرایط آزمایش

2.2.1 شرایط روش کروماتوگرافی مایع

ستون کروماتوگرافی: C18 1.7 میکرومتر 2.1x50mm

فاز متحرک: A: استونیتریل، B: 0.1% اسید فرمیک در آب

سرعت جریان: 0.3 میلی‌لیتر در دقیقه

دمای ستون: 30 درجه سانتی‌گراد

حجم تزریق: 2 میکرولیتر

2.2.2 شرایط روش طیف‌سنجی جرمی

جدول 3 پارامترهای منبع یون‌زایی طیف‌سنجی جرمی

3. نتیجه آزمایش

3.1 آزمایش مناسب بودن سیستم

نتایج آزمایش مناسب بودن سیستم، پیک‌های هدف را به خوبی تعریف شده و بدون تداخل از پیک‌های خارجی نشان داد که تمام الزامات آزمایش را برآورده می‌کند.

شکل 1 کروماتوگرام محلول کاری استاندارد اریترومایسین A (0.5 نانوگرم در میلی‌لیتر)

3.2 محدوده خطی

منحنی کالیبراسیون برای اریترومایسین A با رقیق کردن متوالی محلول استاندارد با استفاده از محلول‌های کاری با غلظت متوسط تهیه شد. این منحنی خطی بودن عالی را در محدوده 0.5-500 نانوگرم در میلی‌لیتر نشان داد، با ضریب همبستگی (R²) بیشتر از 0.99.

جدول 4 محدوده خطی اریترومایسین A

شکل 2 منحنی کالیبراسیون برای اریترومایسین A

3.3 حد تشخیص (LOD) و حد کمی‌سازی (LOQ)

در این روش، حد تشخیص (LOD) و حد کمی‌سازی (LOQ) برای محلول استاندارد اریترومایسین A به ترتیب 0.2 نانوگرم در میلی‌لیتر و 0.5 نانوگرم در میلی‌لیتر تعیین شد. نسبت‌های سیگنال به نویز (S/N) مربوطه 110.02 و 292.20 بود که به طور قابل توجهی از حداقل الزامات 3 و 10 فراتر رفت و در نتیجه معیارهای حساسیت آزمایش را برآورده کرد.

شکل 3. کروماتوگرام‌های یون استخراج شده برای LOD و LOQ اریترومایسین A

3.4 آزمایش دقت

محلول اریترومایسین A به طور متوالی هفت بار تزریق شد که نتایج آن در شکل زیر نشان داده شده است. انحراف زمان نگهداری برای اریترومایسین A 0.19٪ و انحراف مساحت پیک 0.96٪ بود که هر دو کمتر از 5٪ هستند و الزامات آزمایش را برآورده می‌کنند.

شکل 4. کروماتوگرام‌های دقت نمونه اریترومایسین A (7 تزریق)

3.5 آزمایش نمونه

با توجه به روش پیش‌تیمار ذکر شده، مساحت پیک هدف در نمونه جامد 7.4E6 بود. با استفاده از روش استاندارد خارجی محاسبه شد، میزان اریترومایسین A در محلول نمونه 400 نانوگرم در میلی‌لیتر تعیین شد.

شکل 5 کروماتوگرام آزمایش نمونه اریترومایسین A

4. نتیجه‌گیری

این روش از سیستم کروماتوگرافی مایع-طیف‌سنجی جرمی Wayeal LCMS-TQ9200 برای تعیین میزان اریترومایسین A در باقیمانده‌های تخمیر آنتی‌بیوتیک استفاده می‌کند. داده‌ها نشان می‌دهند که این روش عملکرد عالی را نشان می‌دهد: تمام پیک‌های کروماتوگرافی شکل بهینه را بدون دم‌زدگی نشان می‌دهند و حساسیت الزامات آزمایش را برآورده می‌کند. ضریب همبستگی خطی (R²) بیش از 0.99 است. انحراف زمان نگهداری و مساحت پیک برای تمام ترکیبات در هفت تزریق متوالی در 1٪ است که نشان‌دهنده دقت بالا است. کروماتوگرام‌های نمونه هیچ تداخلی از پیک‌های خارجی را نشان نمی‌دهند و میزان نمونه اندازه‌گیری شده 400 نانوگرم در میلی‌لیتر است. این روش مجهز به سیستم Wayeal LC-MS/MS، الزامات تجزیه و تحلیل کیفی و کمی معمول نمونه‌های آزمایش را برآورده می‌کند.