تجزیه و تحلیل کافئین HPLC در نوشیدنی ها: روش Wanyi LC3500 DAD مطابق با GB 5009.139-2014 تأیید شده است

کافئین یک آلکالوئید متیل‌گزانتین است که به طور طبیعی در دانه‌های قهوه، برگ چای و کاکائو یافت می‌شود و یکی از پرکاربردترین افزودنی‌های کاربردی و ترکیبات طعم‌دهنده مشخصه در نوشابه‌های گازدار، نوشیدنی‌های انرژی‌زا، نوشیدنی‌های چای و قهوه‌های آماده مصرف است. مصرف متعادل هوشیاری را تیز می‌کند و خستگی را تسکین می‌دهد، اما مصرف بیش از حد یا طولانی‌مدت می‌تواند باعث تپش قلب، بی‌خوابی و هیجان عصبی شود و گروه‌های حساس مانند زنان باردار، کودکان و افراد با شرایط قلبی عروقی، دوزهای بسیار پایین‌تری را تحمل می‌کنند. بنابراین، استانداردهای ملی ایمنی مواد غذایی، محدودیت‌های صریح کافئین را برای نوشیدنی‌ها تعیین می‌کنند.

در چین، GB 5009.139-2014، استاندارد ملی ایمنی مواد غذایی برای تعیین کافئین در نوشیدنی‌ها، مبنای قانونی برای تعیین کمیت کافئین در ماتریس‌های نوشیدنی است. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) به دلیل جداسازی عالی، مقاومت قوی در برابر تداخل ماتریس و تعیین کمیت بسیار دقیق، به تکنیک ارجح برای ماتریس‌های پیچیده مانند نوشیدنی‌های ترکیبی، نوشیدنی‌های حاوی شیر و نوشیدنی‌های کاربردی گیاهی تبدیل شده است.

یک تولیدکننده نوشیدنی نیاز به تأیید سطوح کافئین در دو خط تولید بسیار متفاوت داشت: یک نوشیدنی گازدار از نوع کولا و یک محصول چای شیر. این دو ماتریس به استراتژی‌های آماده‌سازی متفاوتی نیاز دارند: نمونه‌های گازدار باید گاززدایی و پاکسازی شوند، در حالی که محصولات حاوی شیر نیاز به رسوب پروتئین قبل از تزریق دارند. هر دو باید به راحتی در محدوده کالیبراسیون قرار می‌گرفتند و سیستم کروماتوگرافی باید در طول توالی تزریق طولانی عاری از تجمع ماتریس باقی می‌ماند.

معرف‌ها شامل استاندارد مرجع کافئین، متانول گرید HPLC، اکسید منیزیم، محلول اسید تریکلرو استیک و آب فوق خالص بود.

• محلول مادر (2.0 میلی‌گرم در میلی‌لیتر): 20 میلی‌گرم استاندارد کافئین، وزن شده تا 0.1 میلی‌گرم، حل شده در متانول و به حجم 10 میلی‌لیتر رسانده شده؛ در دمای 4 درجه سانتی‌گراد با ماندگاری شش ماهه نگهداری شود.
• محلول واسطه (200 میکروگرم در میلی‌لیتر): 5.0 میلی‌لیتر از محلول مادر رقیق شده تا 50 میلی‌لیتر با آب؛ در دمای 4 درجه سانتی‌گراد با ماندگاری یک ماهه نگهداری شود.
• محلول‌های کاری کالیبراسیون: 0.5، 1.0، 2.0، 5.0 و 10.0 میلی‌لیتر از محلول واسطه رقیق شده تا 10 میلی‌لیتر، که منجر به 10.0، 20.0، 40.0، 100 و 200 میکروگرم در میلی‌لیتر می‌شود؛ تازه در روز تجزیه و تحلیل آماده شود.

نوشیدنی از نوع کولا: نمونه را در حمام اولتراسونیک در دمای 40 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه گاززدایی کنید. 5 گرم (با دقت 0.001 گرم) وزن کنید، با آب به حجم 5 میلی‌لیتر برسانید به طوری که غلظت کافئین در محدوده کالیبراسیون قرار گیرد، خوب تکان دهید، 0.5 گرم اکسید منیزیم اضافه کنید، دوباره تکان دهید و اجازه دهید ته‌نشین شود. مایع رویی را از غشای 0.45 میکرومتری فیلتر کنید و سپس تزریق کنید.

نوشیدنی‌های قهوه و چای حاوی شیر: 1 گرم (با دقت 0.001 گرم) وزن کنید، با محلول اسید تریکلرو استیک به حجم 10 میلی‌لیتر برسانید، خوب تکان دهید و بگذارید بماند تا پروتئین‌ها رسوب کنند، سپس مایع رویی را از غشای 0.45 میکرومتری فیلتر کنید.

شکل پیک‌ها متقارن بود و تعداد صفحات تئوری بالا بود. تزریق حلال خالی هیچ تداخلی در زمان بازداری کافئین نشان نداد، که تأیید می‌کند پاکسازی با اکسید منیزیم و رسوب پروتئین با اسید تریکلرو استیک اجزای ماتریس را به طور مؤثر حذف می‌کنند. شش تزریق متوالی زمان بازداری و مساحت پیک پایدار را نشان داد که دقت عالی دستگاه را نشان می‌دهد، در حالی که بازیابی بیش از 94% در هر دو ماتریس، حداقل اتلاف نمونه و یک روش آماده‌سازی قوی را اثبات کرد.

با پیروی از GB 5009.139-2014، سیستم HPLC Wanyi LC3500 با آشکارسازی آرایه دیودی یک گردش کار کاملاً اعتبارسنجی شده برای تعیین کافئین در نوشیدنی‌ها ارائه داد. خطی بودن در محدوده 10.0 تا 200.0 میکروگرم در میلی‌لیتر با r > 0.9999، تکرارپذیری کمتر از 0.3% RSD و بازیابی بیش از 94% تأیید می‌کند که این روش برای محصولات گازدار و حاوی شیر دقیق، با تکرارپذیری بالا و قابل تکرار است. حدود تشخیص 0.0446 میلی‌گرم بر کیلوگرم و 0.75 میلی‌گرم بر کیلوگرم، نویز کم و حساسیت بالای سیستم را نشان می‌دهد و آن را برای کنترل کیفیت معمول، تأیید برچسب و آزمایش انطباق با مقررات در تولید نوشیدنی و آزمایشگاه‌های شخص ثالث مناسب می‌سازد.

• آشکارسازی آرایه دیودی در 272 نانومتر، تعیین کمیت انتخابی و کم‌نویز کافئین را در ماتریس‌های رنگی و کدر فراهم می‌کند.
• یک فاز متحرک ساده متانول و آب بر روی ستون C18، انتقال روش بین آزمایشگاه‌ها را سریع و ارزان نگه می‌دارد.
• پاکسازی اختصاصی ماتریس، اکسید منیزیم برای نوشیدنی‌های گازدار و اسید تریکلرو استیک برای نوشیدنی‌های مبتنی بر شیر، از ستون محافظت کرده و عمر مفید آن را افزایش می‌دهد.
• زمان‌های بازداری پایدار و پیک‌های متقارن، تزریق مجدد و کار تکراری را در آزمایشگاه‌های کنترل کیفیت با توان عملیاتی بالا کاهش می‌دهند.